Разработка оптимизированного колориметрического RT

Apr 04, 2023

Том 12 научных отчетов, номер статьи: 21424 (2022) Цитировать эту статью

2099 Доступов

1 Цитаты

2 Альтметрика

Подробности о метриках

Пандемия коронавируса обострила потребность в молекулярных диагностических тестах. Для этой цели широко используется метод полимеразной цепной реакции (ПЦР) — чувствительный и специфичный метод, обычно используемый в качестве золотого стандарта молекулярной диагностики. Однако он требует высококвалифицированного персонала и оборудования, требующего сложного обслуживания, и занимает относительно много времени. Альтернативой является метод петлевой изотермической амплификации (LAMP), который не требует очистки образца или дорогостоящего оборудования и аналогичен ПЦР по чувствительности и специфичности. В этой статье мы разработали оптимизированный колориметрический тест изотермической амплификации с помощью обратной транскриптазы (RT-LAMP) в месте оказания медицинской помощи с использованием портативного устройства для диагностики COVID-19. Были протестированы такие переменные, как концентрация праймеров, сульфата магния, бетаина, гидрохлорида гуанидина, Bst и температура реакций. Мы также создали систему контроля качества пипетирования с использованием комбинации красителей, чтобы избежать ложноотрицательных результатов из-за отсутствия образцов, добавленных в пробирку для реакции. Минеральное масло было включено в состав реакций RT-LAMP, чтобы избежать испарения при отсутствии нагревательной крышки. Окончательный тест RT-LAMP в десять раз более чувствителен по сравнению с колориметрической мастер-миксом WarmStart от New England Biolabs с чувствительностью 5 копий на мкл.

В декабре 2019 года мир стал свидетелем появления нового коронавируса, получившего название «Коронавирус тяжелого острого респираторного синдрома 2» или SARS-CoV-2. Первый случай заражения SARS-CoV-2 был зарегистрирован в Ухане, Китай, и вскоре он распространился по всему земному шару, а в марте 2020 года был зарегистрирован как новая пандемия1. Вспышка пандемии выявила глобальную потребность в молекулярной биологии. тесты для выявления, изоляции и лечения инфицированных людей как средство контроля распространения заболевания.

Полимеразная цепная реакция с обратной транскриптазой (ОТ-ПЦР)2 широко известна как метод «золотого стандарта» молекулярного тестирования РНК-вирусов, таких как SARS-CoV-2. RT-PCR — это метод с высокой чувствительностью и специфичностью, но он требует дорогостоящего и трудоемкого оборудования, обширных этапов очистки образцов и высококвалифицированного персонала. В связи с быстрым ростом числа инфицированных людей стала очевидной нехватка реагентов, материалов, персонала и оборудования для молекулярного тестирования, и мир столкнулся с нехваткой лабораторных ресурсов для удовлетворения спроса.

Петлевая изотермическая амплификация (LAMP) была впервые описана Нотоми и его коллегами в 2003 году как метод амплификации нуклеиновых кислот с высокой специфичностью и эффективностью, который можно проводить в изотермических условиях. Он использует ДНК-полимеразу со смещением цепи (лишенную 5' → 3' экзонуклеазной активности) и набор из двух-трех пар праймеров, предназначенных для создания петель в синтезированной одноцепочечной ДНК. Каждый раз, когда полимераза начинает новую амплификацию, она высвобождает ранее спаренную цепь ДНК, которая образует петлеобразную структуру, содержащую новые сайты связывания полимеразы, создавая тем самым самораспространяющуюся амплификацию. Конечными продуктами реакции являются структуры, подобные цветной капусте, с множеством петель, образующихся в результате отжига между попеременно инвертированными повторами мишени3. Как и в ПЦР, реакции LAMP также могут сочетаться с ферментом обратной транскриптазы для проведения амплификации молекул РНК.

Высокая степень синтеза ДНК, происходящая в реакциях LAMP, позволяет визуально обнаружить положительную реакцию. Всякий раз, когда ДНК-полимераза включает dNTP во вновь синтезированную цепь ДНК, она высвобождает пирофосфат и молекулу протона в качестве побочного продукта. Пирофосфат в присутствии ионов Mg2+ выпадает в осадок в виде пирофосфата магния, изменяя мутность реакции. Высвобождающийся протон снижает pH реакции, что можно обнаружить с помощью pH-чувствительного колориметрического красителя, такого как феноловый красный и бромтимоловый синий4,5.